آب مناسب دستگاه کروماتوگرافی(hplc)

تصویر آب مناسب دستگاه hplc

آب مناسب دستگاه hplc

یکی از دستگاه های بسیار گران قیمت و حساس در آزمایشگاه ها و شرکت های داروسازی،کروماتوگرافی یا همان hplc می باشد که می بایست درآن از آب مناسب دستگاه HPLC استفاده شود.یکی از بزرگترین کاربردهای دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا، آنالیز آمینو اسیدها در نمونه های مختلف می باشد. استفاده از دستگاه HPLC برای آنالیز آمینو اسید ها بیشتر متوجه حوزه های صنایع غذائی، پزشکی و بیوتکنولوژی می باشد و با توجه به این کاربرد می بایست حتما از آب مخصوص دستگاه HPLC که همان آب دیونیزه فوق خالص می باشد استفاده کرد.

دستگاه کروماتوگرافی یا HPLC چیست؟

دستگاه HPLC از تجهیزات آنالیز دستگاهی در آزمایشگاه می باشد که با جداسازی اجزای موجود در یک نمونه مایع در ستون کروماتوگرافی، زمینه اندازه گیری دقیق آن ترکیبات را توسط دتکتور فراهم می آورد. با توجه به کاربردهای گسترده دستگاه HPLC، استفاده از آن در سال های اخیر بطور چشمگیری افزایش داشته است.
از آنجایی که کروماتوگرافی فاز معکوس (Reversed Phase Chromatography) معمولاً به عنوان تکنیکی برای آنالیز یا جداسازی مواد آلی استفاده می شود، آب مورد استفاده برای تهیه فاز های متحرک یا نمونه ها باید به اندازه کافی عاری از هر ماده آلی باشد. با این وجود، سطح خلوص مورد نیاز به آشکارساز مورد استفاده بستگی دارد. در صورت استفاده از آشکارساز جذب ماوراء بنفش، به طور معمول توصیه می شود از آب مقطر فوق خالص یا آب دیونیزه فوق خالص استفاده شود.

آب مقطر برای دستگاه کروماتوگرافی(hplc)

بسیاری از خریداران و دارندگان دستگاه hplc بدنبال خرید آب مقطر برای دستگاه کروماتوگرافی خود می باشند.آب مقطر برای دستگاه کروماتوگرافی یا همان hplc مناسب نمی باشد.از دلایل مهمی که می توان گفت که خرید آب مقطر برای دستگاه hplc مناسب نمی باشد،می توان به موارد رسانایی آب مقطر،سختی،رسوب و عناصر موجود در آب مقطر اشاره کرد.
آب مقطر در بهترین حالت ممکن دارای رسانایی 1 میکرو زیمنس می باشد که همین سطح هدایت الکتریکی در آب دیونیزه براساس پارامترهای جهانی 0/05 میکرو زیمنس می باشد.آب مقطر خالص هنوز دارای کمی املاح و رسوب می باشد و این در حالی است که آب مناسب hplc فاقد املاح و رسوب می باشد.از دیگر تفاوت های آب مقطر و آب دیونیزه مخصوص hplc میتوان به عناصر موجود در آبها اشاره کرد.در آب مقطر تمامی عناصر با کمی کاهش وجود دارند اما در آب دیونیزه تمامی عناصر آب حذف شده و همین عامل آب یونزدایی شده را به آبی فوق خالص تبدیل کرده است.

مشخصات آب مناسب دستگاه HPLC

ویژگی ها و مشخصات آب مناسب و مخصوص دستگاه کروماتوگرافی(HPLC) به قرار زیر می باشد:

  • مقاومت الکتریکی : 17 مگا اهم
  • هدایت الکتریکی : 0/1 میکرو زیمنس در سانتی متر مربع
  • سختی آب : صفر
  • فاقد املاح و رسوب
  • حذف تمامی عناصر مانند نیترات،سدیم،فلوراید و آهن
  • فاقد RNA و DNA
  • 10PPB : TOC
  • 6.5 : PH

شرایط نگهداری آب مناسب دستگاه HPLC

تصویر آب مخصوص hplc

یکی از نکات مهم و حیاتی در مورد آب یا هر مایعی،شرایط نگهداری آن مایع می باشد.در اینجا بر خود واجب دانستیم که شرایط نگهداری آب مناسب دستگاه HPLC را برای شما بازگو کنیم:

  • همواره این مایع و آب در ظرف پلی اتیلن نو و درجه یک نگهداری شود
  • آب مناسب دستگاه کروماتوگرافی می بایست در دمای 25 درجه سانتی گراد و حتی زیر 25 درجه سانتی گراد نگهداری شود
  • همواره به دور از نور خورشید و گرما باشد
  • دور از دسترس کودکان قرار بگیرد
  • این آب غیر قابل آشامیدن می باشد

روشهاي صحيح استفاده از دستگاه HPLC

عدم رعايت اصول صحيح در تهيه و استفاده از فاز متحرك مشكلات فراواني براي سيستم HPLC به وجود مي آورد. بارزترين اين مشكلات عبارتند از:

  • جدا شدن گازهاي محلول از فاز متحرك در پمپ ها
  • حبس شدن حباب هوا يا ذرات ناخالص در Cell مربوط به دتكتور.
  • وجود تركيبات ناخواسته در فاز متحرك
  • آسيب رساني به check valve ها و seal wash ها
  • گرفتكي In line filter ها، فريت ها و لوله ها
  • كاهش دقت حجم تزريق

اين مشكلات ميتوانند از راههاي مختلف كارايي سيستم HPLC را كاهش دهند از جمله از طريق:

  • بالا رفتن فشار معكوس
  • تلاطم در base line به علت نوسان در جريان فاز متحرك
  • عدم تكرار پذيري در زمان بازدارندگي
  • غير عادي بودن طيف
  • خطا در نتايج كيفي و كمي
براي جلوگيري از بروز مشكلات مي بايد از حلال با خلوص HPLC يا اسپكتروسكوپي استفاده شود. مواد شيميايي مورد نياز جهت تهيه فاز متحرك و آماده سازي نمونه ها و استانداردها می بایست دارای خلوص بالا باشند.كليه حلالهاي مورد نياز جهت تهيه فاز متحرك، بخصوص نمك ها و بافرها، بايد از صافي 0.45 ميكرون عبور داده شوند. دقت شود كه نوع صافي با حلال مورد نظر سازگار باشد. پس از صاف كردن، در ظرف مناسب درب دار نگهداری شود.
با خرید آب دیونیزه 4 لیتری درسآب،علاوه بر داشتن آبی  ULTRA PURE ، آبی فوق خالص با مقاومت 18 مگا اهم و رسانایی 0/05 میکروزیمنس خواهید داشت و حتما توجه داشته باشید که  فاز متحرك در ظرف شيشه ای نگهداری شود. قبل از استفاده ظروف نگهداري با فاز متحرك شستشو داده شوند. از مواد شوينده استفاده نشود و اگر مورد استفاده قرارگرفت، بلافاصله با آب مناسب کروماتوگرافی و سپس با متانول شستشو داده و با هوا خشك شود و سپس با متانول شستشو داده و با هوا خشك شود.
هواگيري ناقص فاز متحرك سبب بيش از 70 درصد مشكلات در HPLC مي باشد. انجام هواگيري مناسب مزاياي زير را به دنبال دارد:
  • كرارپذيري زمان بازداري
  • پبات در عملكرد پمپ ها
  • پبات خط پايه

معمولاً از يك يا چند روش زير جهت هواگيري فاز متحرك استفاده مي شود:

  • فيلتر كردن در خلاء
  • استفاده از سونيكيت
  • هواگيري با جريان مداوم گاز خنثي مثل هليوم (Sparging)

در ابتداي مسير حلال حتماً از solvent inlet filter استفاده شود. نصب كرد يك شيلنگ جريان ازت بر روی سطح حلال باعث جلوگيری از انحلال مجدد هوا در فاز متحرك مي شود.حلال های فاز متحرك نبايد در طول موج تنظيم شده براي آشكارساز جذب نوري، داراي جذب باشند.جهت جلوگيري از رشد قارچ ها و باكتري ها رعايت نكات زير ضروري مي باشد:

  • تهيه فاز متحرك، فيلتر و هواگيري آن براي هر روز كاري تكرار شود.
  • نگهداري فاز متحرك در ظروف شيشه اي تيره رنگ صورت بگيرد.
  • در صورتيكه قرار باشد سيستم HPLC به مدت طولاني غير فعال باشد، ابتدا كل سيستم با آب مناسب دستگاه HPLC شستشو داده و سپس با مخلوطي از حداقل 10 درصد حلال آلي ( متانول يا استونيتريل) و آب مخصوص HPLC شستشو داده شود.
  • در مواقعي كه سيستم HPLC غير فعال باشد، آب HPLC يا بافر به تنهايي داخل آن نباشد.
  • باقي مانده حلالهاي فاز متحرك كه قديمي شده باشد استفاده نشود و فاز متحرك جديد تهيه شود.
  • در صورتي كه فاز متحرك حاوي بافر باشد، سيستم HPLC به طور مرتب با آب فوق خالص دیونیزه HPLC شستشو داده شود تا از تشكيل رسوب نمكهاي بافر جلوگيري شود.
  • جهت تغيير فاز متحرك از حلال آبي به بافر، حتماً از فاز ميانه اي مثل آب با خلوص HP و مناسب HPLC استفاده گردد.
  • فازهاي متحرك كه از مخلوط كردن حلالهاي آلي با بافر تشكيل ميشود بايد پس از تهيه فيلتر شوند زيرااحتمال تشكيل رسوب وجود دارد.
  • براي احاطه بهتر به خواص حلالهاي فاز متحرك از جداول خواص فيزيكي و شيميايي (گرانروي، نقطه جوش، قابليت امتزاج با ديگر حلالها …) استفاده شود.

آماده سازي و كنترل نمونه ها:

  • ابتدا كنترل چشمی جهت بررسی شفافيت نمونه، عدم وجود رسوب و همگن بودن آن انجام شود.
  • بررسی اطلاعات مربوط به نمونه: نوع زمينه، PH نمونه، غلظت املاح آن انجام شود
  • قبل از تزريق، نمونه ها بايد توسط صافي هاي يكبار مصرف 22 يا 0.45 ميكرون صاف شوند.
  • نمونه هاي غليظ حتماً رقيق شوند
  • در صورتيكه نمونه ها بسيار رقيق باشند، بايد روش آماده سازي نمونه ها طوري تنظيم شود كه غلظت بالاتري به دست آيد و به حداقل تشخيص آشكارساز برسد
  • در بسياري از موارد، بخصوص نمونه هاي زيستي و عصاره هاي مواد طبيعي، تعداد مواد مخلوط در نمونه خيلي زياد است و فازهاي ثابت كروماتوگرافي توانايي جداسازي همه تركيبات از همديگر را ندارند. لذ انجام پاكسازی نمونه در مرحله آماده سازی ضروری مي باشد.
  • در بعضي موارد آماده سازی خوب سبب افزايش كيفيت كروماتوگرافي ( منحني با قرينه بهتر) مي شود.
  • آماده سازی صحيح نمونه بر جنبه اقتصادی تجزيه كراماتوگرافی تأثير دارد، زيرا در صورتيكه غلظت نمونه كمتر از حداقل توانايی آشكارساز باشد و يا غلظت مواد ناخواسته زياد باشد، آناليز كراماتوگرافی با شكست مواجه مي شود.
  • در اغلب موارد زمينه اصلی نمونه پس از انجام مراحل آماده سازی نمونه، تغيير پيدا ميكند.
  • در عين حال كه آماده سازی نمونه ضروری است ولي بايد سعی شود مراحل آن به حداقل برسد، تعدد مراحل سبب افزايش خطای تجزيه می شود.

 

نگهداري از ستون HPLC

مهمترين عواملي كه در حفظ و كارايی ستون HPLC  به ما كمك می كند به شرح ذيل می باشند:

  • هميشه به محدوده مجاز PH براي ستون توجه شود. به عنوان مثال براي ستون هاي فاز معكوس C18 از جنس سيليكا خارج از محدوده 7/5-2 نبايد استفاده شود.
  • از تغييرات ناگهانی در عبور جريان فاز متحرك و فشار داخل سيستم HPLC جلوگيری شود.
  • فاز متحرك فقط پس از فيلتراسيون و هواگيری از ستون عبور داده شود.
  • در مرحله آماده سازی نمونه ها از روش های پيشرفته مانند استخراج با فاز جامد استفاده شود.
  • جهت كاهش آلودگی ستون از محافظ ستون استفاده شود.
  • قبل از خاموش كردن سيستم HPLC، ستون با آب مناسب دستگاه HPLC  شستشو داده شود.
  • زماني كه ستون بلا استفاده است آن را در يك حلال مناسب نگهداری كنيد. به عنوان مثال برای ستون های فاز معكوس C18 در مخلوطی از حلال آلی متانول يا استونيتريل و آب مناسب و مخصوص HPLC با نسبت 80-20 يا استونيتريل خالص نگهداری شود.
  • بالا رفتن فشار معكوس ستون علامت خوبی برای زمان تعويض محافظ ستون می باشد.
  • موقع راه انداختن سيستم HPLC، به خصوص زمانيكه سيستم مدت طولانی بدون استفاده مانده است، ابتدا ستون فاز معكوس را با حلال آلی ( متانول يا استونيتريل) به مقدار 20-10 بار معادل حجم ستون، جهت فعال كردن گروههای پيوند داده شده، شستشو داده سپس فاز متحرك عبور داده شود.
  • جريان فاز متحرك به تدريج افزايش يابد تا از تغيير ناگهاني فشار داخل سيستم HPLC جلوگيری شود.
  • شستشو با فاز متحرك تا رسيدن به خط پايه يكنواخت و متعادل بايد ادامه يابد.

در صورتی که با خواندن این مقاله هنوز سوالات و ابهاماتی در رابطه با آب مناسب و مخصوص دستگاه کروماتوگرافی دارید، کافیست در بخش دیدگاه ها و نظرات برای ما بنویسید تا به آنها پاسخ دهیم.

بدون دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *